Конфокальная сканирующая оптическая микроскопия. Kонфокальная лазерная сканирующая микроскопия Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
Введение.
Конфокальный микроскоп отличается от "классического" оптического микроскопа (см. ) тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой (красные лучи на рис. 1б ), проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек (например, синие лучи на рис. 1б ) в основном задерживается диафрагмой. Вторая особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку (рис. 1в) . Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом (рис. 1г) . Такая схема к тому же облегчает юстировку.
Рис. 1а. Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца.
Рис. 1б. Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области.
Рис. 1в. Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку.
Рис. 1г. Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива
(для подсветки и сбора отраженного сигнала).
Разрешение и контрастность в конфокальном микроскопе.
Рассмотрим теперь математически, каким образом и насколько количественно изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF, см. определение в ) имеет вид
Для качественного понимания удобно рассматривать каждую PSF как вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами , либо что фотон будет зарегистрирован из точки с координатами , тогда конфокальная PSF есть произведение независимых вероятностей. На рис. 2 приведено изображение обычной PSF и конфокальной PSF.
Рис. 2. Конфокальная PSF показана справа, а обычная PSF – слева .
Если использовать критерий Релея для разрешения (провал 26% от максимума распределения), то мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа
в то время как для обычного микроскопа
Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0.04%. На рис. 3 приведен практический пример, когда это важно. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) не возможно обнаружить в обычный микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше того, что предписано критерием Релея. В то же самое время, в конфокальный микроскоп (нижняя часть рисунка 3) данный объект должен хорошо регистрироваться.
Рис. 3. Распределение интенсивности для случая обычного микроскопа (верхний рисунок) и конфокального микроскопа (нижний рисунок).
Максимум интенсивности тусклого объекта в 200 раз меньше, чем интенсивность яркого [1
].
Распределение интенсивности вдоль оптической оси для конфокального микроскопа определяется выражением
Тогда пользуясь критерием Релея получим разрешение вдоль оптической оси
Здесь важно отметить, что не следует путать разрешение вдоль оптической оси и глубину фокуса в обычном микроскопе. Обычно глубина фокуса в сотни раз превышает разрешение вдоль оптической оси.
Влияние диафрагмы в фокальной плоскости.
Один из параметров, который никак не фигурировал в данном выше описании - это размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Отметим, что при анализе мы молчаливо предполагали источник точечным и именно в этом предположении получили функцию размытия точки (PSF) для обычного и конфокального микроскопа. Полученные PSF описывают свойства объективной линзы, а изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, увеличивает уровень шума и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.
Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы. Однако размер диафрагмы примерно в 3-5 раза больше пятна Эйри представляется наиболее подходящим компромиссом. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.
Для того, чтобы учесть наличие диафрагмы математически и построить новую функцию распределения интенсивности, следует выполнить свертку
а для конфокального микроскопа уже полученную функцию умножать на . Результирующее распределение интенсивности для случая диафрагмы с размером 5 пятен Эйри приведено на рис. 4 .
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии
Н.Н. ЛУКАШЕВА1 , С.Б. ТКАЧЕНКО1 , Н.Н. ПОТЕКАЕВ2 , Т.С. КУЗЬМИНА1 , Е.А. ВАСИЛЕВСКАЯ1
1 Лаборатория по изучению репаративных процессов в коже НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова; 2 кафедра
кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова
Lifetime-period reflecting confocal laser scan microscopy: the history of foundation, the principle of functioning, possibilities of using in dermatology
N.N. LUKASHEVA1 , S.B. TKACHENKO1 , N.N. POTEKAEV2 , T.S. KUZ’MINA1 , E.A. VASILEVSKAYA1
1 Laboratory by studying of reparative processes in the skin of Research Institute of molecular medicine of I.M. Sechenov Moscow medical academy; 2 FPPOP of I.M. Sechenov Moscow medical academy
Одной из тенденций современной медицины является применение неинвазивных органосохраняющих методов исследования. Благодаря научным разработкам и внедрению в практику инновационных технологий в последнее десятилетие появились новые неинвазивные высокоразрешающие методы исследования структуры кожи и других тканей. К ним относятся оптическая когерентная томография, высокочастотное ультразвуковое сканирование, ядерно-магнитный резонанс, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ). Последний метод занимает особое место среди визуализирующих технологий, так как позволяет получить изображение эпидермиса и поверхностной части дермы с разрешением, приближенным к традиционной световой микроскопии .
Основная концепция конфокальной микроскопии была разработана M. Minsky в середине 50-х годов прошлого столетия с целью исследования нейронной сети в нативном препарате ткани головного мозга без предварительного окрашивания . Это изобретение осталось без внимания в силу отсутствия на тот момент мощного источника света, необходимого для получения изображения, а также должного компьютерного оборудования для обработки полученной информации. Вслед за M. Minsky в 60-х годах M. Egger и M. Petran создали многолучевой конфокальный микроскоп с применением вращающегося диска для исследования неокрашенного препарата ткани головного мозга и клеток ганглиев . В 1973 г. благодаря работам M. Egger по дальнейшему совершенствованию конфокального лазерного сканирующего микроскопа впервые были
Klin Dermatol Venerol 2008;5:10-15
опубликованы различимые изображения клеток, полученные с помощью данного метода . Развитие компьютерных и лазерных технологий в 70-80-х годах прошлого столетия, а также возможность получения цифровых изображений привели к росту интереса к конфокальной микроскопии . И в 80-х годах несколько групп исследователей продемонстрировали использование тандемного сканирующего конфокального микроскопа для изображения тканей человека и животных in vivo . Вскоре после того как закончился патент M. Minsky, чертежи конфокального лазерного сканирующего микроскопа были использованы несколькими исследователями для создания рабочих аппаратов. Голландский физик G.F. Brakenhoff разработал конфокальный сканирующий микроскоп в 1979 г. , почти одновременно с ним C. Sheppard внес свой вклад в метод теорией создания изображения . T. Wilson, W. Amos и J. White разработали концепцию и позднее, в 80-х годах прошлого столетия, продемонстрировали полезность конфокальных изображений в исследовании флюоресцирующих биологических образцов . Первый коммерчески доступный аппарат появился в 1987 г. В 90-х годах достижения в оптике и электронике позволили создать более мощные и надежные лазеры, сканирующие зеркальные элементы с высоким коэффициентом полезного действия, высокопроизводительную волоконную оптику, более тонкий слой диэлектрического покрытия и детекторы, уменьшившие шумовые характеристики . Благодаря появившимся в конце 90-х годов высокоскоростным компьютерным системам, увеличенным мониторам и технологиям, позволяющим запоминать большой объем информации, наступил новый взрывной этап в развитии КЛСМ по количеству применений, на которые она могла быть
нацелена. Первые сообщения о применении конфокального лазерного сканирующего микроскопа для получения изображений кожи человека in vivo были опубликованы в 1995 г. . Отражательная конфокальная микроскопия, применяемая в дерматологии, была разработана М. Rajadhyaksha и соавт. и улучшена «Lucid Inc» . В 90-х годах группы исследователей (S. Gonzalez и соавт.) занимались изучением различных патологических состояний кожи с помощью отражательной конфокальной микроскопии и показали большую значимость данного метода как полезного диагностического инструмента .
В зависимости от применяемого источника света существуют разные виды конфокальной микроскопии. Конфокальная микроскопия может выполняться с использованием лазера в качестве источника света или без него. В тандемном сканирующем конфокальном микроскопе обычно используется ртутная лампа. По сравнению с тандемным сканирующим конфокальным микроскопом при КЛСМ используется лазерный луч определенной длины волны и высокой мощности освещения . Кроме того, различают флюоресцентную и отражательную КЛСМ. Благодаря своей безопасности и неинвазивности прижизненная отражательная КЛСМ является более предпочтительной в использовании .
Основной принцип отражательной КЛСМ основан на использовании точечного источника света (лазерный луч), освещающего маленькое пятно внутри ткани, с последующим улавливанием отраженного света через оптически соединенную апертуру (вкрапление) (рис. 1). Отраженный свет проходит через вкрапление, в результате чего только находящийся в фокусе свет достигает детектора, в то время как свет вне фокуса отклоняется. Таким образом, определяется единственный план внутри образца, который расположен в фокусе. Числовая апертура линзы объектива, длина волны и размер открытой апертуры (вкрапления) определяют разрешение изображения, получаемого с помощью отражательной КЛСМ. Лазеры различных длин волн могут быть использованы в качестве источника света для отражающей конфокальной микроскопии. Более длинные, близкие к инфракрасным, длины волн проникают глубже в кожу, но дают более низкое разрешение по сравнению с короткими длинами волн видимого спектра. Отражение света возникает в результате местных различий в коэффициенте преломления внутри ткани. Для отдельных органелл и структур оно обусловлено разницей в коэффициентах преломления по сравнению с ближайшим окружением. Меланосомы дают сильное отражение с длинами волн видимого (400-700 нм) и близкого инфракрасного (700-1064 нм) спектров из-за высокого индекса преломления по сравнению с окружающим эпидермисом. Поэтому клетки, содержащие
Рис. 1. Схема работы конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
меланин, такие как базальные кератиноциты и меланоциты, дают яркое изображение .
Существуют конфокальные сканирующие лазерные микроскопы различных фирм-произво- дителей: Vivascope 1000, 1500, 2500 Lucid Inc., Rochester, NY; Optiscan F900, Optiscan Pty. Ltd., Notting Hill, VIC, Australia и др. (рис. 2). При использовании конфокального лазерного микроскопа Vivascope 1500, Lucid Inc. лазерное сканирование осуществляется на длине волны 830 нм с оптической мощностью не более 16 мВт, которое не вызывает повреждения ткани или поражение глаза. Линза объектива дает 30-кратное увеличение (NA 0,9), при этом боковое разрешение составляет приблизительно 1 мкм и осевое разрешение (сечение толщины) 5 мкм. В микроскопе используется водная иммерсионная линза, так как коэффициент преломления воды близок к коэффициенту преломления эпидермиса , и это сводит к минимуму сферическую аберрацию, вызванную поверхностными эпидермальными слоями клеток, когда воспроизводится изображение глубже в дерме. Сканирование производится в плоскостях XY 4×4 мм с размером кадра 0,5×0,5 мм, частотой 9 кадров в секунду. С помощью этой системы можно получить изображение нормальной кожи на глубине от 200 до 400 мкм, достаточной для изображения эпидермиса и верхней части дермы (сосочковой и верхней ретикулярной). Отсканированное через иммерсионный объектив Lucid Stable View изображение с разрешением 1000×1000 точек обрабатывается программой
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Рис. 2. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп VivaScope 1500 «Lucid Inc».
Vivascope Ver.7,0 и передается на цветной монитор 19′′, имеющий максимальное разрешение 1280×1024 точек . При использовании микроскопа Vivascope 1500 не нужно применять контрастные вещества. Получение изображений возможно благодаря естественному контрасту и различиям в коэффициенте рефракции компонентов кожи, таких как меланин и кератин . Во время воспроизведения изображения используется специальное устройство для контакта с кожей, чтобы уменьшить образование артефактов. Оно содержит воду или гель на границе раздела фаз. Это устройство состоит из металлического кольца, которое фиксируется на коже пациента путем прилипания и соединяется с микроскопом, снабженным магнитом. Данное устройство имеет вогнутую форму, для того чтобы вмещать иммерсионную среду.
Метод КЛСМ позволяет получать изображения эпидермиса и поверхностной части дермы с разрешением, приближенным к традиционной световой микроскопии. С помощью данного метода можно получить изображения не только придатков кожи, но и отличить клетки различных слоев эпидермиса, волокна сосочкового слоя дермы, оценить состояние капилляров дермы. Можно исследовать морфологию разных клеток, определять размер, форму клеточных и субклеточных структур . Основное отличие КЛСМ от традиционного гистологического исследования заключается в том, что
получаемые изображения слоев кожи ориентированы горизонтально (параллельно) поверхности кожи (en face ), а также они представляют собой полутоновые изображения . В связи с этим могут возникать затруднения в трактовке полученных результатов и при сравнении изображений, полученных с помощью прижизненной КЛСМ и данными классической биопсии. С помощью КЛС микроскопа могут быть получены отдельные изображения сечений кожи, а также записаны небольшие кинофильмы для демонстрации динамических процессов, происходящих в коже, например кровотока .
Основными преимуществами прижизненной КЛСМ являются быстрота получения результата обследования по сравнению с классическим патогистологическим исследованием, которое включает в себя этапы иссечения маленького кусочка ткани (биопсию), фиксацию, нарезание на тонкие слои (сечения), окрашивание красителями и последующее изучение с помощью световой микроскопии. КЛСМ не изменяет ткани в ходе исследования, как это имеет место при гистологическом исследовании в результате получения сечений и их окрашивания, таким образом, минимизируется появление артефактов. Кроме того, процедура безболезненна, проходит без повреждения кожных покровов, не оставляет рубцовые изменения. Метод позволяет оценивать динамику заболеваний, а также дает возможность оперировать в режиме реального времени (при микрографической хирургии) .
Первые работы по применению КЛСМ в дерматологии были связаны с получением конфокальных изображений структуры здоровой кожи и последующим их анализом. В работах M. Rajadhyaksha, S. Gonzalez и соавт. , M. Huzaira и соавт. , K.J. Busam и соавт. приводятся подробные описания конфокальных изображений отдельных слоев эпидермиса, дермы, сосудистой сети, придатков кожи (отдельные сальные железы, сально-волосяные фолликулы, потовые протоки). Помимо качественных характеристик, даются морфометрическая оценка размеров клеток, глубины расположения и толщины слоев эпидермиса, оценка отдельных волокон и пучков коллагена сосочковой и верхней части ретикулярной дермы, приведены диаметр просветов капилляров, а также размеры отдельных клеток крови в просветах капилляров. K.J. Busam и соавт. , T.Yamashita и соавт. в своих статьях дают качественную оценку меланоцитам, приводят морфологические признаки меланоцитов, пигментированных кератиноцитов, меланофагов, позволя-
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
ющие различать указанные клетки на изображениях, полученных методом прижизненной КЛСМ. В ряде представленных работ дается оценка топографических особенностей строения здоровой кожи, проводится анализ возрастных изменений кожных покровов, влияния инсоляции на строение эпидермиса и дермы здоровых людей. Понимание того, как выглядят изображения здорового эпидермиса и дермы, имеет значение для последующего определения патологических изменений в коже.
Большое количество меланина, представленного в меланоцитарных очагах, делает пигментные новообразования кожи (невусы, меланома) идеальными для изображения и диагностики методом прижизненной КЛСМ . Целью любого визуализирующего метода, применяемого в дерматологии, является диагностика меланомы на ранних стадиях заболевания, так как от этого зависит эффективность проводимой терапии. Результаты исследований K.J. Busam и соавт. , G. Pellacani и соавт. , R. Langley и соавт. , A. Gerger и соавт. показали, что меланома может быть достаточно успешно диагностирована с помощью метода КЛСМ. Наличие плеоморфных ярких клеток внутри эпидермиса и дермы, которые могут быть звездообразной формы, обладать крупными ветвящимися отростками и эксцентрично расположенными крупными ядрами, а также нарушение архитектоники шиповатого слоя за счет нечетких границ клеток и ярких серых частиц (вероятно, меланина), распространенных внутри эпидермиса, позволяет диагностировать меланому . Внутриэпидермальная меланома также может быть диагностирована с помощью данного метода на основании критериев, которые применяются в традиционной гистологии. Конфокальные изображения внутриэпидермальных меланом позволили выявить увеличенное число интрадермальных увеличенных (атипичных) меланоцитов в солитарных единицах во всех слоях эпидермиса, включая верхние зернистый и шиповатый слои . Необходимо указать, что некоторые признаки меланом могут быть определены и в беспигментных меланомах . Однако следует отметить, что малые размеры выборок, на которых были проведены исследования, пока не позволяют судить о чувствительности и специфичности представленных критериев конфокальных изображений в постановке диагноза меланомы.
K.J. Busam и соавт., R. Langley и соавт. указывают на такие признаки меланоцитарных невусов на конфокальных изображениях, как наличие маленьких мономорфных круглых или овальных, сильно преломляющих свет клеток с центрально расположенными ядрами. Эти клетки могут быть видны внутри эпидермиса, в дермоэпидермальном соединении, типично окружая дермальный сосочек, и в поверхностной дерме в зависимости от вида невуса.
Они часто сгруппированы в круглые кластеры (гнезда), содержащие несколько клеток, расположенные вблизи кровеносных сосудов. Архитектура рогового, зернистого, шиповатого и базального слоев при этом остается неизмененной . Диспластические невусы характеризуются локальным уменьшением границ взаимодействия между кератиноцитами в дермоэпидермальном соединении, наличием характерных ярких гранул внутри эпидермиса (вероятно, меланиновых телец), большим разнообразием в размерах и форме невомеланоцитов, хотя они все еще имеют склонность быть более круглыми или овальными, чем ветвящимися. Приведенные исследования свидетельствуют о том, что признаки меланоцитарных невусов хорошо коррелируют с традиционной гистологической картиной. Однако остается до конца неизвестным, можно ли точно определить данным методом злокачественные клетки с малым количеством пигмента. Для выяснения этого вопроса необходимо проведение дальнейших исследований.
Метод прижизненной КЛСМ позволяет определять атипичные области, подозрительные в отношении неопластических очагов. В проанализированной литературе работы, посвященные изучению актинического кератоза, принадлежат D. Aghassi и соавт. , изучению плоскоклеточной карциномы - M. Horn и соавт. , исследованию базалиомы - M. Goldgrier и соавт. , A.L. Agero и соавт. , S. Nori и соавт. , K. Sauermann и соавт. . КЛСМ позволяет определять границы очага до начала терапии, что может быть полезным в оценке границ опухолей с радиальным характером роста, включая злокачественную лентиго-меланому, некоторые базалиомы или опухоли, трудные для клинического осмотра, например, склерозирующие инфильтративные базалиомы. Ключевые гистопатологические признаки актинического кератоза, выявляемые с помощью КЛСМ, включают архитектурный беспорядок, увеличение ядер эпидермиса с плеоморфизмом, паракератоз, что ведет к организованному беспорядку. В настоящее время глубина проникновения лазера является главным ограничением КЛСМ для диагностики актинического кератоза . Конфокальными признаками базалиомы - наиболее часто встречающейся опухоли кожи человека, являются островки мономорфных опухолевых клеток вытянутой формы с характерными вытянутыми ядрами, ориентированными вдоль той же самой оси. Эта картина однообразно ориентированных клеток проходит через всю толщу эпидермиса, теряя нормальную, напоминающую пчелиные соты модель, и архитектуру дермальных сосочков. Обильные кровеносные сосуды, демонстрирующие чрезмерную извилистость, также как и преимущественно мононуклеарный воспалительный инфильтрат, смешанны или тесно расположены с клетками базалиомы
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Результаты выполненного S. Nori и соавт. большого ретроспективного многоцентрового исследования показали значимую точность признаков, выявляемых при КЛСМ, для диагностики базалиомы in vivo . Таким образом, КЛСМ позволяет в реальном времени определить наличие резидуальной или клинически сомнительной базалиомы. По данным ряда исследований, КЛСМ помогает в скорой оценке границ опухолей при микрографической хирургии в ходе исследования эксцизионных образцов во время операции . Ограничивающими факторами в использовании прижизненной КЛСМ для диагностики опухолей кожи в настоящее время являются ограниченная глубина исследования, которая препятствует получению точных изображений ниже поверхностной дермы, и наличие преломляемости воспалительных клеток, среди прочих.
Выполненные в 90-х годах рядом исследователей (S. Gonzalez и др.) работы по изучению различных воспалительных состояний кожи с помощью отражательной конфокальной микроскопии позволили выявить большую значимость данного метода как полезного диагностического инструмента . Наибольшее преимущество метода заключается в том, что он позволяет в реальном времени оценивать динамические процессы при воспалительных заболеваниях кожи и, что очень важно, оценивать эффективность проводимой терапии дерматозов . С помощью прижизненной КЛСМ оценены воспалительные изменения при псориазе , аллергическом и простом контактном дерматитах , фолликулите , дерматомикозах , бородавках , простом герпесе , системном склерозе . На конфокальных изображениях признаки вульгарного псориаза в стационарной стадии соответствуют обычной гистологической картине и включают паракератоз, микроабсцессы Мунро, акантоз, расширение капилляров, папилломатоз . Отчетливо видны границы воспалительного очага . С помощью КЛСМ в режиме реального времени визуализируются такие типичные признаки контактного дерматита, как спонгиоз, образование микровезикул, воспалительный инфильтрат и местами эпидермальный некроз . С использованием данного метода были продемонстрированы патогистологические особенности простого и аллергического дерматитов, а также показано, что конфокальная микроскопия может применяться для оценки расовых (у представителей негроидной и европеоидной расы) особенностей острого контактного дерматита . Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия позволяет быстро, в реальном времени обнаруживать ветви гиф и воспалительный инфильтрат in vivo или iv vitro с ногтевых пластинок и кусочков кожи . Фолликулит, изображенный с помощью конфокальной микроскопии, может быть окончательно диагностиро-
ван путем прямой демонстрации внутриэпидермальных пустул, воспалительного инфильтрата, спонгиоза и дилатации капилляров . Бородавки на конфокальных снимках характеризуются гиперкератотическим роговым слоем и наличием множественных сильно преломляющих округлых структур размером 20-40 мкм внутри очага, что позволяет быстро и окончательно поставить диагноз . Герпетической инфекции кожи соответствуют плеоморфные баллонирующие кератиноциты и многоядерные гигантские клетки в свободной совокупности с кератиноцитами и воспалительными клетками .
Таким образом, метод прижизненной КЛСМ позволяет in vivo оценивать патоморфологические изменения в коже при различных дерматозах, включая неопластические очаги, меланоцитарные невусы, меланому, что, несомненно, подтверждает полезность данного инструмента в диагностике различных дерматологических заболеваний. Учитывая неинвазивный характер метода, возможность повторного многократного исследования одних и тех же очагов, представляется, что КЛСМ в большей степени полезна при оценке динамических изменений, происходящих в коже в ходе эволюции заболеваний и на фоне проводимой терапии дерматозов.
Несмотря на явные полезные стороны прижизненной КЛСМ, существуют также некоторые ограничения и сложности в применении данного метода. Настоящая техника сложна и затратна, и поэтому не очень широко доступна исследователям и клиницистам. Тем не менее несколько групп ученых в институтах и в промышленности разрабатывают более простые, менее затратные сканирующие технологии. Разрабатываются также более портативные аппараты по сравнению с ныне существующими, так как громоздкие установки неудобны в использовании при обследовании труднодоступных областей тела. Ограничивающим фактором в использовании прижизненной КЛСМ является ограниченная глубина исследования, которая препятствует получению точных изображений ниже поверхностной дермы. Продолжается работа по созданию вертикально ориентированных сечений, которые были бы сходны с теми, что мы видим при гистологическом исследовании, так как это значительно бы увеличило возможности прижизненной КЛСМ. Большую научную проблему составляет трактовка изображений
Способность читать, интерпретировать и анализировать конфокальные изображения с тем, чтобы выделить полезную клиническую и гистологическую информацию. Несколько групп ученых по всему миру выполняют детальные исследования, чтобы характеризовать конфокальные изображения и провести их корреляцию с гистологией. Одной из важных проблем остается определение чувствительности и специфичности данного метода исследования в диагностике разных дерматозов .
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
ЛИТЕРАТУРА
1. Abramovits W., Stevenson L.C. Changing paradigms in dermatology: new ways to examine the skin using noninvasive imaging methods. Clinics in Dermatology 2003; 21: 353-358.
2. Minsky M. Microscopy apparatus. US Pat 1961; 467.
3. Minsky M. Memoir on inventing the confocal scanning microscopy. Scanning 1988; 10: 128-138.
4. Egger M.D., Petran M. New reflected-light microscope for viewing unstained brain and ganglion cells. Science 1967; 157: 305-307.
5. Davidovits P., Egger M.D. Photomicrography of corneal endothelial cells in vivo. Nature 1973; 244: 366-367.
6. Amos W.B., White J.G. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell 2003; 95: 335-342.
7. Brakenhoff G.J., Blom P., Barends P. Confocal scanning light microscopy with high aperture immersion lenses. J Microscopy 1979; 117: 219- 232.
8. Sheppard C.J.R., Wilson T. Effect of spherical aberration on the imaging properties of scanning optical microscopes. Applied Optics 1979; 18: 1058.
9. Hamilton D.K., Wilson T. Scanning optical microscopy by objective lens. Scanning, Journal of Physics E: Scientific Instruments 1986; 19: 52-54.
10. Pawley J.B. Handbook of biological confocal microscopy. New York: Plenum Press 1995.
11. Gonzalez S., Swindells K., Rajadhyaksha M., Torres A. Changing paradigms in dermatology: confocal microscopy in clinical and surgical dermatology. Clin Derm 2003; 21: 359-369.
12. Rajadhyaksha M., Grossman M., Esterowitz D. et al. In vivo confocal scanning laser microscopy of human skin: melanin provides strong contrast. J Invest Dermatol 1995; 104: 946-952.
13. Rajadhyaksha M., Gonzalez S., Zavislan J.M. Son R.R. et al. In vivo confocal scanning laser microscopy of human skin II: advances in instrumentation and comparison to histology. J Invest Dermatol 1999; 113: 101-112.
14. Confocal laser microscope images tissue in vivo. Laser Focus World 1997; 33: 119-127.
15. Rajadhyaksha M., Zavislan J.M. Confocal reflectance microscopy of unstained tissue in vivo. Retinoids 1998; 14: 26-30.
16. Gonzalez S., Rajadhyaksha M., Anderson R.R. Non-invasive (realtime) imaging of histologic margin of a proliferative skin lesion in vivo. J Invest Dermatol 1998; 111: 538-539.
17. Gonzalez S., Gonzalez E., White W.M. et al. Allergic contact dermatitis: correlation of in vivo confocal imaging to routine histology. J Am Acad Dermatol 1999; 40: 708-713.
18. Swindle L.D., Thomas S.G., Freeman M., Delaneyz P.M. View of normal human skin in vivo as observed using fluorescent fiber-optic confocal
microscopic imaging. J Invest Dermatol 2003; 121: 706- 712.
19. Delaney P.M., Harris M.R., King R.G. Novel microscopy using fiber optic confocal imaging and its suitability for subsurface blood vessel imaging in vivo. Clin Exp Pharmacol Physiol 1993; 197: 20.
20. Busam K.J., Charles C., Lohmann C.M. et al. Detection of intraepidermal malignant melanoma in vivo by confocal scanning laser microscopy. Melanoma Research 2002; 12: 349-355.
21. Aghassi D., Anderson R.R., González S. Confocal laser microscopic imaging of actinic keratoses in vivo: a preliminary report. J Am Acad Dermatol 2000; 43: 42-48.
22. Руководство по эксплуатации VivaScope 1500 Lucid Inc.
23. Corcuff P., Bertrand C., Leveque J.L. Morphometry of human epidermis in vivo by real-time confocal, microscopy. Arch Dermatol Res 1993; 285: 475-481.
24. Meyer L.E., Otberg N., Richter H., Sterry W. et al. New prospects in dermatology: fiber-based confocal scanning laser microscopy. Laser Physics 2006; 16: 5: 758-764.
25. Serup J., Jemec G.B.E., Grove G.L. Handbook of non-invasive methods and the skin. 2nd ed. CRC Press 2006; 32: 267-276.
26. Huzaira M., Rius F., Rajadhyaksha M., Anderson R.R. et al. Topographic variations in normal skin, as viewed by in vivo reflectance confocal microscopy. J Invest Dermatol 2001; 116: 846-852.
27. Busam K.J., Charles C., Lee G., Halpern A.C. Morphologic features of melanocytes, pigmented keratinocytes and melanophages by in vivo
confocal scanning laser microscopy. Mod Pathol 2001; 14: 9: 862- 868.
28. Yamashita T., Kuwahara T., Gonzalez S., Takahashi M. Non-invasive visualization of melanin and melanocytes by reflectance-mode confocal microscopy. J Invest Dermatol 2005; 124: 235-240.
29. Sauermann K., Clemann S., Jaspers S., Gambichler T. et al. Age related changes of human skin investigated with histometric measurements by confocal laser scanning microscopy in vivo. Skin Research and Technology 2002; 8: 52-56.
30. Sauermann K., Jaspers S., Koop U., Wenck H. Topically applied vitamin C increases the density of dermal papillae in aged human skin. BMC Dermatology 2004; 4:13 doi:10.1186/1471-5945-4-13.
31. Pellacani G., Cesinaro A.M., Seidenari S. Reflectance-mode confocal microscopy of pigmented skin lesions-improvement in melanoma diagnostic specificity. J Am Acad Dermatol 2005; 53: 979-985.
32. Langley R.G.B., Rajadhyaksha M., Dwyer P.J., Sober A.J. et al. Confocal scanning laser microscopy of benign and malignant melanocytic skin lesions in vivo. J Am Acad Dermatol 2001; 45: 365-376.
33. Gerger A., Koller S., Kern T., Massone C. et al. Diagnostic applicability of in vivo confocal laser scanning microscopy in melanocytic skin tumors. J Invest Dermatol 2005; 124: 493-498.
34. Busam K.J., Hester K., Charles C. et al. Detection of clinically amelanotic malignant melanoma and assessment of its margins by in vivo confocal scanning laser microscopy. Arch Dermatol 2001; 137: 923-929.
35. Horn M., Gerger A., Koller S. et al. The use of confocal laser-scanning microscopy in microsurgery for invasive squamous cell carcinoma. British Journal of Dermatology 2007; 156: 81-84.
36. Goldgrier M., Fox C.A., Zavislan J.M. et al. Noninvasive imaging, treatment and microscopic confirmation of clearance of basal cell carcinoma. Dermatol Surg 2003; 29: 205-210.
37. Agero A.L.C., Busam K.J., Benvenuto-Andrade C. Reflectance confocal microscopy of pigmented basal cell carcinoma. J Am Acad Dermatol 2006; 54: 638-643.
38. Nori S., Rius-Dıaz F., Cuevas J. et al. Sensitivity and specificity of reflectance-mode confocal microscopy for in vivo diagnosis of basal cell сarcinoma: a multicenter study. J Am Acad Dermatol 2004; 51: 923-930.
39. Sauermann K., Gambichler T., Wilmert M. et al. Investigation of basal cell сarcinoma by confocal laser scanning microscopy in vivo. Skin Research and Technology 2002; 8: 141-147.
40. Gonzalez S., Sackstein R., Anderson R.R., Rajadhyaksha M. Real-time evidence of in vivo leukocyte trafficking in human skin by reflectance confocal microscopy. J Invest Dermatol 2001; 117: 2: 384-386.
41. González S., Rajadhyaksha M., Rubinstein G., Anderson R.R.
Characterization of psoriasis in vivo by reflectance confocal microscopy. J Med 1999; 30: 337-356.
42. Astner S., Gonzalez E., Cheung A.C. et al. Non-invasive evaluation of the kinetics of allergic and irritant contact dermatitis. J Invest Dermatol 2005; 124: 351-359.
43. Hicks S.P., Swindells K.J., Middelkamp-Hup M.A. et al. Confocal histopathology of irritant contact dermatitis in vivo and the impact of skin color (black vs white). J Am Acad Dermatol 2003; 48: 727-734.
44. Gonzalez S., Rajadhyaksha M., Gonzalez-Serva A. et al. Confocal reflectance imaging of folliculitis in vivo: correlation with routine histology. J Cutan Pathol 1999; 26: 201-205.
45. Markus R., Huzaira M., Anderson R.R., Gonzalez S. A better potassium hydroxide preparation? In vivo diagnosis of tinea with confocal microscopy. Arch Dermatol 2001; 137: 1076-1078.
46. Hongcharu W., Dwyer P., Gonzalez S., Anderson R.R. Confirmation of onychomycosis by in vivo confocal microscopy. J Am Acad Dermatol 2000; 42: 214-216.
47. Goldgeier M., Fox C.A., Muhlbauer J.E. Immediate noninvasive diagnosis of herpesvirus by confocal scanning laser microscopy. J Am Acad Dermatol 2002; 46: 783-785.
48. Sauermann K., Gambichler T., Jaspers S. et al. Histometric data obtained by in vivo confocal laser scanning microscopy in patients with systemic sclerosis. BMC Dermatology 2002; 2: 8.
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) является методом оптического трехмерного (3D) поверхностного профилирования с высокой разрешающей способностью.
Высокая числовая апертура линзовых объективов (до 0.95) и короткая длина волны лазерного излучения обеспечивают получение изображений с высоким разрешением вдоль оптического и поперечного направлений.
Также конфокальные микроскопы обладают значительным контрастом по сравнению с классическими оптическими микроскопами за счет использования специальной диафрагмы (пинхол), отсекающей поток фонового рассеянного света - это помогает улучшить качество изображения.
В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движение образца или перестройка оптической системы). Для того чтобы регистрировать свет только от одной точки после объектива располагается пинхол таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через него и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек отрезается данным пинхолом.
Повышение контраста изображения также достигается за счет того, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться за счет использования светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.
Получение изображения в режиме реального времени достигается за счет модуля быстрого сканирования и алгоритма обработки сигналов. Для получения 3D профиля поверхности образца требуется менее 1 секунды. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия является техникой оптического неразрушающего контроля для профилирования поверхностей микроструктур с высоким разрешением. Это является идеальным решением для измерения и проверки полупроводниковых пластин, FPD продуктов, MEMS устройств, поверхностей стекла и других материалов.
Способность измерения высоты достигается благодаря конфокальному расположению источника, образца и детектора. Когда образец находится в фокальной плоскости объектива, свет, отраженный на поверхности образца, фокусируется на конфокальное отверстие, а фотодетектор собирает сигнал от образца. Однако образец помещают в положение не в фокусе, и световой сигнал отклоняется конфокальной диафрагмой. Таким образом, только сигнал в фокусе попадает на фотодетектор. Этим объясняется оптическая селективная способность CLSM технологии.
Для получения 3D профиля поверхности образца, оптические изображения собираются вдоль оси Z. Благодаря конфокальному отверстию интенсивность света максимальна, когда образец располагается в фокальной плоскости.
Максимальная интенсивность излучения регистрируется в фокальной плоскости. Интенсивность уменьшается, когда образец отводится от фокальной плоскости.
Для точного нахождения максимальной интенсивности используется многоточечное позиционирование вблизи максимального положения. Это обеспечивает максимальную воспроизводимость измерения высоты. Высота рассчитывается путем аппроксимации кривой на каждом пикселе. С помощью этой высотной карты строится профиль поверхности образца.
Как уже говорилось выше, важными параметрами данной технологии являются высокое разрешение и высокий контраст. В наших конфокальных микроскопах (серии NS-3500) эти параметры улучшены за счет использования пьезоэлектрических приводов для перемещения сканирующей головки в диапазонах 200 мкм и 400 мкм с шагом в 0.1 нм в режиме точного сканирования, что позволяет получать изображения поверхности образцов с еще более высоким разрешением и контрастом, чем у других конфокальных микроскопов. Данная особенность позволяет анализировать и получать трехмерные изображения мельчайших структур, исследовать до нескольких слоев прозрачных покрытий на различных микросхемах, проводить анализ микроглубоких структур (например, анализ микро- и нанотрещин нефтяных и газовых труб, поршней двигателей автомобилей, закрылок самолетов и т.п.).
Другим важным аспектом для конфокальной микроскопии является необходимость наличия инструмента для анализа полученной информации. Наше простое и интуитивное программное обеспечение позволяет с легкостью анализировать полученные изображения с цифровым разрешением до 0.001 мкм. Также оно предоставляет Вам возможность анализировать большие образцы за счет сканирования малых областей и их последующего сшивания, проводить анализ шероховатости и отдельных пирамидальных и конусообразных микроструктур (что особенно важно при контроле солнечных элементов) и т.п. Дополнительная система автофокусировки и наличие ПЗС-камеры еще больше упрощают процедуру измерения и позволяют Вам полностью сосредоточиться на исследовании, не отвлекаясь на второстепенные действия.
CLSM имеет множество применений в промышленных областях, поскольку это быстрый, неразрушающий и надежный способ 3D профилирования поверхностей. Лазерный конфокальный микроскоп может измерять 3D форму, высоту ступеньки, объем микроструктур, ЖК панели, полупроводниковые пластины, MEMS устройства, поверхности материалов, прозрачные стеклянные поверхности. Кроме того, конфокальная микроскопия широко используется для биологических исследований.
ООО «Мелитэк» поставляет лазерные конфокальные микроскопы. Это современное исследовательское оборудование, которое значительно отличается по своим возможностям от обычных световых микроскопов. С его помощью можно получить не только двухмерные, но и трехмерные изображения, получить информацию о профиле поверхности, измерить толщину полупрозрачных покрытий и пр.
Лазерный конфокальный микроскоп находит свое применение в качестве инструментального микроскопа для измерения линейных размеров, углов, радиусов и пр. Благодаря точности измерения такие микроскопы подходят для контроля качества измерительных, металлообрабатывающих и медицинских инструментов, микроэлектронных компонентов и иных деталей, контроль которых подразумевает проведение измерений в плоскостях XY, XZ и YZ, Одной из особенностей микроскопа LEXT OLS5000 является возможность построения моделей и проведения измерений поверхностий с углом наклона до 87.5 0
Лазерный микроскоп дает возможность изучать структуру и топографию поверхности с возможностью определения перепадов высоты до 6 нм у прозрачных и непрозрачных образцов, что обуславливает его широкое применение в материаловедении, криминалистике и микроэлектронике. Благодаря лазерному источнику света с длиной волны 405 нм подсветке, конфокальной оптической схеме, а так же применении. ФЭУ вместо обычных CMOS или CCD детекторов микросоп LEXT OLS5000 обладает очень малой глубиной резкости, что позволяет определять высоту фокальной плоскости и строить высокоточные 3D модели поверхности. Специальное программное обеспечение позволяет проводить измерение профиля, площади и объема полученных моделей. В плоскости разреза модели можно проводить измерение линейных размеров, радиусов окружностей и углов. Изображения и модели сохраняются в специальном формате, который позволяет провести дополнительные измерения при необходимости.
Характерные особенности, нового конфокального микроскопа LEXT OLS5000:
- определение перепада высот 6 нм
- латеральное разрешение 120 нм
- гарантированная точность измерения линейных размеров на изображениях, полученных методом панорамной сшивки;
- высокая скорость сканирования благодаря специальным алгоритмам;
- повышенная контрастность за счет двойной конфокальной схемы
- цветные изображения с разрешением 4К;
- возможность работать с образцами различных размеров и формы
- инновационные алгоритмы подавления шумов при сканировании.
Специальная модель рамы позволяет проводить измерения образцов высотой до 210 мм, а новые объективы, скорректированные для работы с лазером 405 нм с увеличенной рабочей дистанцией, позволяют исследовать поверхности в углублениях до 25 ммОписания и технические характеристики микроскопов для измерения линейных размеров, представленных в каталоге ООО «Мелитэк», вы найдете на нашем сайте. Если у вас есть вопросы, на них готовы ответить наши сотрудники.
4 июня 2013Значительная часть проводимых на биологическом факультете МГУ научных исследований, успешная реализация тесно связанных с ними образовательных программ, немыслимы без применения самой современной микроскопической техники. В рамках Программы развития Московского университета на биологическом факультете была создана, полностью оснащена необходимым оборудованием и эффективно работает межкафедральная лаборатория конфокальной микроскопии.
Фибробласты 3Т3 на стенках макропоры матрикса
Текст: Третьяков Артемий
Что может делать?
С помощью конфокального микроскопа можно получить несколько изображений виртуальных срезов клетки, или же собранную из них трехмерную модель. Такие возможности дает лазер, луч которого можно фокусировать в любой точке клетки. Для получения изображения объект должен быть флуоресцентно активен, то есть при попадании луча лазера он (а точнее, определенные молекулы в его составе) должен испускать свет с большей длиной волны, чем попадающий на него, который и улавливается микроскопом. Изображение строится как раз на основе этой флуоресценции.
Фото
Как работает?
«Современный уровень развития фундаментальных и прикладных междисциплинарных научных исследований, а также задачи подготовки специалистов, обладающих междисциплинарными компетенциями, требуют интенсивного развития и модернизации материально-технической базы» (Программа развития Московского университета, стр. 5 ;).
Кроме лазера в состав электронномеханического устройства входит также оптический фильтр, пропускающий луч лазера, но отражающий более длинноволновый свет на диафрагму, называемую «пинхолом» (от англ. Pinhole – проделанная булавкой дырка, дословный перевод отлично характеризует устройство пинхола), которая отсекает весь ненужный фоновый свет и тем самым снижает или вовсе сводит на нет влияние нижележащих оптических слоев на четкость отображения сканируемого участка клетки. Если бы фоновый свет не отсекался пинхолом, то оптические слои накладывались бы друг на друга и мешали наблюдателю – будто бы он смотрит сквозь листву вдаль. За диафрагмой располагается фотоприемник, оцифровывающий получаемую информацию.
Понятно, что такое «точечное» сканирование требует времени. Чтобы ускорить этот процесс в конфокальной системе используется еще один модуль, называемый спиннинг-диском, позволяющий за один акт работы лазера получить изображение не одной точки, а целой линии.
Патент на такую систему был получен в 1961 году профессором Массачусетского технологического института Марвином Минским. Активное ее использование началось в 80-х годах, а сейчас конфокальная микроскопия переживает свой расцвет. В России первый микроскоп появился в 2003 году, это был Axiovert 200M LSM510 Meta. За ним последовали другие, и теперь в нашей стране существует несколько крупных лабораторий, в числе которых и межкафедральная лаборатория на биологическом факультете МГУ. В распоряжении лаборатории пять микроскопов, в том числе: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.
Конфокальная микроскопия добилась не только высочайшего контраста и трехмерности, она освоила и четвертое измерение – время, позволив изучать изменения, происходящие в клетках. Для этих целей каждая установка снабжена системами поддержания их жизни. Все это дает широкие возможности для исследователей, которые этими возможностями с успехом пользуются.
И, раз уж речь идет о лаборатории биологического факультета МГУ, в качестве примеров следует упомянуть проведенные в этой лаборатории исследования.
Шелк и паутина
Конфокальная микроскопия добилась не только высочайшего контраста и трехмерности, она освоила и четвертое измерение – время, позволив изучать изменения, происходящие в клетках.
Одной из интересных работ является создание биодеградируемых протезов для восстановления сосудов и других полых органов. Такие тканеинженерные конструкции внешне представляют собой, в наиболее простых случаях, трубки или пленки, надевающиеся на место повреждения и выполняющие, таким образом, роль «заплатки». Их можно изготовить из разных материалов, в том числе из фиброина шелка коконов шелкопряда. Достоинство этого материала в том, что он стабилен и формирует гибкую и прочную структуру протеза. Сам протез выглядит как пленка только при рассмотрении невооруженным глазом, на самом деле он представляет собой матрикс - сетчатую многослойную основу, каркас, имитирующий строение живой ткани. Этот каркас помогает новым клеткам занять правильное положение, обеспечивая их равномерное распределение. В результате поврежденная стенка органа восстанавливается, а ставший ненужным каркас подвергается биодеградации. Но проверить, насколько равномерно распределяются по каркасу клетки, а также хорошо ли им живется в глубоких слоях матрикса (нет ли затруднений в газообмене и обмене продуктами метаболизма), и не изменяют ли они при проникновении внутрь него морфологии, не так-то просто. Именно на этом этапе применение микроскопа (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) сильно упростило задачу. В основном за счет возможности исследовать объект без разрушения, а также за счет способности микроскопа смотреть внутрь матрикса на глубину до 600 мкм.
Фото
Похожие работы были проведены и с костной тканью, матрикс для которой изготавливали как из того же фиброина, так и из спидроина - белка, изначально обнаруженного в организме паука и использующегося им для плетения паутины. В лабораторных условиях белок производят совсем не пауки, а дрожжи, в чей геном внедрен немного измененный ген паука, ответственный за синтез этого белка.
Не все так просто
Но, если возникновение повреждений в тканях – процесс простой и понятный, другие патологии понятны далеко не всегда. И прежде чем начать эффективное лечение и, тем более, предотвращение их развития, нужно выяснить механизм их возникновения. К числу таких относится атеросклероз - болезнь артерий, в результате которой в стенке сосуда, а точнее, в интиме – ее внутреннем слое, накапливаются липиды, делающие стенку толще, что в конечном итоге может привести даже к полной закупорке сосуда. Из-за чего возникает это заболевание, не совсем понятно, как и непонятно то, какую роль играют иммунокомпетентные клетки, в местах скопления которых вскоре начинается атерогенез. Полноценные ответы на эти вопросы еще не найдены, но изучение атерогенеза продолжается, хоть и публикаций на эту тему куда меньше, чем на тему тканеинженерных протезов.
Фото
Судьбы молекул
Межкафедральную лабораторию конфокальной микроскопии регулярно используют в своей работе более 20 студентов и аспирантов с почти 10 кафедр.
В описанных выше исследованиях в основном отслеживается состояние клеток. Но этим возможности конфокального микроскопа не ограничены, он вполне способен отследить даже судьбу отдельной молекулы в клетке – лишь бы она обладала флуоресцентной активностью. Для этого молекулы обычно метят флуорохромами – специальными красителями, имеющими эту активность. Флуорохромы существуют в виде отдельных молекул, и мечение ими заключается в химическом связывании флуорохрома с интересующей исследователя молекулой. После этого такие меченые молекулы попадают в клетку и их дальнейшую судьбу отслеживают при помощи микроскопа. Таким способом сравнивали, например, активность и перемещения в клетке рицина и вискумина. Оба вещества – белковые токсины, оба имеют растительное происхождение и состоят из двух частей – субъединиц, одна из которых ответственна за связывание с клеткой и проникновение внутрь, а другая – за инактивацию рибосомы, что в конечном итоге ведет к гибели клетки. Практическая польза опять же связана с лечением еще одного опасного заболевания – рака. Такое четкое «разделение обязанностей» между субъединицами позволяет заменить первую субъединицу, например, на антитело. Получится «иммунотоксин», действующий только на определенные клетки, к которым это антитело подойдет. Основных проблем две. Первая: выбор антитела, которое будет подходить к раковым клеткам и не допускать проникновения токсина в здоровые. И вторая: выбор токсина, который при превращении в иммунотоксин будет сохранять высокую эффективность.
Фото : Первичная культура клеток сердца новорожденных крысят: А - контроль, Б - обработанных 20мкМ изопротеренола в течении суток. 1 - окраска митохондрий TMRE; 2 - фазовый контраст. Шкала 10мкм. (Смирнова Т.А., Сапрунова В.Б. "Адаптационные изменения митохондрий культивируемых кардиомиоцитов новорожденных крысят под воздействием изопротеренола". Международная конференция "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" 24-26 МАЯ 2011г. Пущино).
Обучение
Список проведенных с использованием конфокальной микроскопии работ можно продолжать долго. Эффективный метод, к тому же позволяющий работать с живыми клетками, востребован практически в любом научном исследовании. И поэтому огромную роль играет подготовка студентов к работе в этой лаборатории. Регулярно ее посещают более 20 студентов и аспирантов, занимающихся курсовыми, предкурсовыми и дипломными работами.
Работают на установках эмбриологи, молекулярные биологи, цитологии, биоинженеры, иммунологи, зоологи.
Лаборатория конфокальной микроскопии основана в 2004 году.
Заведующий лабораторией – доцент М.М.Мойсенович
В лаборатории работают молодые специалисты А.А.Рамонова и А.Ю.Архипова
В настоящее время в лаборатории установлены 2 конфокальные системы:
- Axiovert 200M с конфокальной приставкой LSM510 META (Carl Zeiss, Германия)
- Конфокальная лазерная сканирующая система, производства "НИКОН КОРПОРЕЙШН" (Япония) - микроскоп медико-биологический инвертированный для лабораторных исследований Eclipse с принадлежностями: со штативом Ti-E, с TIRF-осветителем, с конфокальным модулем А1 и конфокальным модулем на основе спиннинг-диск.
Все новости »
